【万象城AWC(中国)基因检测】唇裂基因检测技术的进展与应用

唇裂（Cleft Lip）是一种常见的先天性颅面畸形，通常分为非综合征性唇裂伴腭裂（NSCLP）和非综合征性单纯唇裂（NSCLO）。近年来，随着基因检测技术的开展，唇裂基因检测技术更新团队能够更深入地唇裂致病基因鉴定基因解码唇裂的遗传背景，从而为疾病的早期诊断、预防和个体化治疗给予新思路。《唇裂发生的原因查找与跟踪》将介绍唇裂的基因检测技术及其在唇裂致病基因鉴定基因解码和临床应用中的进展。

样本收集与唇裂致病基因鉴定基因解码背景

在唇裂基因检测的唇裂致病基因鉴定基因解码中，样本的收集和分析是关键的第一步。唇裂基因检测技术更新团队在2017年至2019年期间招募了159例NSCL/P患者，其中包括79例NSCLP和80例NSCLO患者，这些患者均在四川大学华西口腔医院接受手术治疗。此外，还收集了542名未受影响的对照组数据，这些数据来自于万象城AWC(中国)基因致病基因鉴定基因解码的全基因组测序（WGS）数据，覆盖度为39.89×。在随后的唇裂致病基因鉴定基因解码中，唇裂基因检测技术更新团队又在2004名NSCL/P患者和1823名对照组中进行了一轮重要单核苷酸多态性（SNPs）的复制唇裂致病基因鉴定基因解码，并在1729名NSCL/P患者、995名非综合征性腭裂（NSCPO）患者和996名健康对照中进行了第二轮复制唇裂致病基因鉴定基因解码。所有参与者均为汉族人群。

为了确保唇裂致病基因鉴定基因解码的伦理合规性，所有参与者或其监护人均签署了知情同意书。该唇裂致病基因鉴定基因解码取得了四川大学华西口腔医院医院伦理委员会（WCHSIRB-D-2018-012R1）的批准，并遵循《流行病学观察性唇裂致病基因鉴定基因解码报告强化标准》（STROBE）指南。

目标区域的测序准备与实施

基因选择与目标区域

唇裂致病基因鉴定基因解码人员根据中国汉族（CHB）和日本（JPT）人群的HapMap连锁不平衡（LD）结构，选择了位于IRF6基因周围的目标区域进行测序。具体选择了位于染色体1的209,923,704至210,382,027（Hg19）区域，长度为458.323 kb，涵盖了IRF6基因的编码和非编码区域。

测序文库的制备

为了有效捕获和富集目标区域的基因片段，唇裂致病基因鉴定基因解码团队使用了Agilent液相捕获系统（Agilent SureSelectXT Custom Kit）。具体步骤如下：

基因组DNA片段化：使用Covaris粉碎仪将1.0 μg基因组DNA样本剪切成180至280 bp的片段。
文库构建：进行末端修复和A尾添加，然后将特异性索引接头连接到片段两端，以制备DNA文库。
目标区域捕获：将DNA文库与生物素标记的探针杂交，并顺利获得含链霉素的磁珠捕获目标区域。
PCR扩增与质量检测：对捕获区域进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，并进行文库质量检测。
高通量测序：最终在Illumina Hiseq 4000平台上进行双端150 bp的测序。

基因分型与统计分析

基因分型技术

在复制唇裂致病基因鉴定基因解码中，选择的SNPs顺利获得SNPscan方法进行基因分型，该方法基于双连接和多重荧光PCR。为确保基因分型的准确性，随机选择了4%的样本进行重复分析。

统计分析

使用PLINK软件对SNP进行统计分析，包括哈迪-温伯格平衡（HWE）检验、关联分析、单体型关联的滑动窗口分析和条件逻辑分析。唇裂基因检测技术更新团队从发现阶段选择了5个显著的SNPs进行进一步复制唇裂致病基因鉴定基因解码，选择标准如下：

最小次等位基因频率：GnomAD_EAS_AF和1000基因组_EAS≥0.3。
连锁不平衡区块：根据1000基因组数据库中的CHS&CHB连锁不平衡区块，选择标记SNPs以最大限度地覆盖所有显著的SNPs。

经过Bonferroni多重校正，目标测序阶段的关联分析P值显著性阈值为4.59E-05，第一轮复制Prep1为0.0033，第二轮复制Prep2和综合P值Pcomb为0.0042。使用Haploview计算成对连锁不平衡，同时根据以下公式计算人群归因风险百分比（PAR%）：PAR% = [Pe (RR − 1) / RR] × 100（Pe为病例中等位基因的流行率，RR为相对风险；比值比OR用作RR的代理）。

定量实时PCR分析

在进行基因表达分析时，唇裂致病基因鉴定基因解码人员收集了54名NSCLO和32名微型唇裂（MCL）患者的唇部组织样本，这些样本是在患者约1岁时进行唇裂修复手术时收集的。样本总RNA使用RNA-easy Isolation Reagent（Vazyme）提取，并使用PrimeScript RT试剂盒和TB Green Fast qPCR混合物（Takara）进行反转录为cDNA和进一步的定量实时PCR（RT-qPCR）分析。最终，使用GAPDH作为参考基因，顺利获得2–ΔΔCt方法分析IRF6的相对表达水平。